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泥鳅喜欢栖息于静水的底层，常出没于湖泊、池塘、沟渠和水田底部富有植物碎屑的淤泥表层，对环境适应力强。生活水温10～30℃，最适水温为25～27℃，故应属温水鱼类。当水温升高至30℃时，泥鳅即潜入泥中度夏。冬季水温下降到5℃以下时，即钻入泥中20～30cm深处越冬。
泥鳅不仅能用鳃和皮肤呼吸，还具有特殊的肠呼吸功能；当天气闷热或池底淤泥、腐植质等物质腐烂，引起严重缺氧时，泥鳅也能跃出水面，或垂直上升到水面，用口直接吞入空气，而由肠壁辅助呼吸，当它转头缓缓下潜时，废气则由肛门排出。每逢此时，整个水体中的泥鳅都上升至水面吸气，此起彼伏，故西欧人对它有“气候鱼”之称。冬季寒冷，水体干涸，泥鳅便钻入泥土中，依靠少量水分使皮肤不致干燥，并全靠肠呼吸维持生命。待翌年水涨，又出外活动。
由于泥鳅忍耐低溶氧的能力远远高于一般鱼类，故离水后存活时间较长。在干燥的桶里，全长4～5厘米的泥鳅幼鱼能存活1小时，而全长12厘米的成鱼可存活6小时，并且将它们放回水中仍能活动正常。泥鳅多在晚上出来捕食浮游生物、水生昆虫、甲壳动物、水生高等植物碎屑以及藻类等，有时亦摄取水底腐植质或泥渣。泥鳅2冬龄即发育成熟，每年4月开始繁殖（水温18℃），产卵在水深不足30厘米的浅水草丛中，产出的卵粒粘附在水草或被水淹没的旱草上面。孵出的仔鱼，常分散生活，并不结成群体。